GIÁO TRÌNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM

896
Hình 3.2. Cơ chế tổng hợp cephalosporin C ( giai đoạn cuối từ penicillin N)
GIÁO TRÌNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM
5 (100%) 3 votes

GIÁO TRÌNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA – BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIÁO ÁN MÔN HỌC

CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM

( 5 ĐƠN VỊ HỌC TRÌNH)

BIÊN SOẠN: GVC.TS. TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH

ĐÀ NẴNG 2007

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men các chất kháng sinh, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 2005
[2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tỵ, Vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo dục1997
[3] Lê văn Hiệp: Văcxin ho gà Miễn dịch và công nghệ, Nhà xuất bản y học Hà Nội 2004
[4] Bài giảng về kháng sinh, trường Đại học Dược Hà Nội
[5] Erick j. Vandamme, Marcel Dekker, Biotechnology of industrial Antibiotic, Inc., New York 1984
[6] McKane, Larry, McGraw-Hill, Microbiology, Inc.1996
[7] Harvey W. Blanch, Stephen Drew and Daniel I. C. Wan, Comprehensive Biotechnology, Pergamon Press, 1985
[8] H.. Weide, J. Páca und W. A. Knorre,, Biotechnology, VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1987

NỘI DUNG CHƯƠNG TRÌNH

PHẦN MỞ ĐẦU:

ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH

1.1. Giới thiệu lịch sử các chất kháng sinh.
1.2. Định nghĩa kháng sinh.
1.3. Đơn vị đo kháng sinh.
1.4. Phân loại kháng sinh.
1.5. Phương pháp định lượng kháng sinh.
1.6. Giá trị sử dụng điều trị của kháng sinh.
1.7. Chức năng sinh học của kháng sinh (cơ chế sinh kháng sinh).
1.8. Hiện tượng và bản chất của sự kháng thuốc.
1.9. Nguyên tắc điều hoà sinh tổng hợp kháng sinh.

PHẦN 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT MỘT SỐ KHÁNG SINH

CHƯƠNG 1: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PENICILLIN

1.1. Điểm lịch sử phát hiện và công nghệ sản xuất Penicillin.
1.1.1. Điểm lịch sử ( phát hiện năm 1928; tinh chế thành công 1939; sản xuất công nghiệp 1940; lên men chìm penicillin G 1942; tinh chế được axit 6- aminopenicillanic 1959…)
1.1.2. Định nghĩa và công thức hoá học tổng quát của penicillin.
1.2. Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin.
1.2.1. Tuyển chọn chủng công nghiệp.
1.2.2. Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc Penicillium chrysogenum.
1.2.3. Phương pháp kiểm tra và định lượng penicillin.
1.2.4. Tác động của các thông số công nghệ đến quá trình lên men.
– Sự phát triển hệ hơi và đặc điểm hình thái sợi.
– Đặc tính nhiệt động của dịch lên men.
– Thành phần môi trường lên men.
– Điều kiện tiến hành lên men (nhiệt độ, pH, oxy, khuấy trộn, CO2).
1.3. Qui trình sản xuất penicillin công nghiệp.
* Đặc điểm chung của qui trình (4 công đoạn: Lên men, tinh chế, sản xuất các chế phẩm bán tổng hợp, sản xuất thuốc Penicillin bán tổng hợp.
1.4. Lên men
1.4.1. Chuẩn bị lên men (nhân giống, chuẩn bị môi trường và thiết bị…).
1.4.2. Các kỹ thuật lên men (gián đoạn, bán liên tục, đặc điểm về thiết bị…).
1.4.3. Hiệu quả kinh tế chung của quá trình lên men.
1.5. Xử lý dịch lên men và tinh chế thu penicillin.
1.5.1. Lọc .
1.5.2. Trích ly.
1.5.3. Tẩy màu.
1.5.4. Kết tinh và sấy thu penicillin tự nhiên.
1.6. Sản xuất các chế phẩm beta-lactam bán tổng hợp từ penicillin G.
1.6.1. Nhu cầu sản xuất chế phẩm bán tổng hợp.
– Cơ chế tác dụng.
– Sự kháng thuốc và hướng giải quyết.
– Mở rộng đặc tính và hiệu quả điều trị cho chế phẩm.
1.6.2. Sản xuất 6-APA và sản xuất các penicillin bán tổng hợp.
– Sản xuất 6-APA (phương pháp hoá học, phương pháp enzym).
– Sản xuất penicillium bán tổng hợp (Phương pháp hoá học, phương pháp enzym)
1.6.3. Sản xuất các cephalosporin bán tổng hợp từ penicillin G.
1.6.4. Sản xuất các chế phẩm beta-lactam bán tổng hợp có hoạt tính kìm hãm beta-lactamase

CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT MỘT SỐ CHẤT KHÁNG SINH KHÁC
PHẦN 3: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACXIN CHO NGƯỜI
3.1. Cơ sở sinh hóa của công nghệ sản xuất vắc xin
3.1.1. Hệ thống miễn dịch của cơ thể
– Hệ thống miễn dịch tự nhiên
– Hệ thống miễn dịch thu được
– Các cơ quan và tế bào tham gia phản ứng miễn dịch
3.1.2. Tính đặc hiệu và ghi nhớ miễn dịch
3.2. Vắc xin
3.2.1. Vài nét về lịch sử và hướng phát triển của công nghệ vắc xin
3.2.2. Nguyên lý sử dụng vắc xin
3.2.3. Đặc tính cơ bản của một vắc xin: tính miễn dịch, tính kháng nguyên, hiệu lực, tính không độc
3.2.4. Các vắc xin: vắc xin bất hoạt, vắc xin dưới tổ hợp, vắc xin tái tổ hợp,
giải độc tố
4.3. Công nghệ sản xuất vacxin
4.3.1. Cơ sở cho việc thiết kế các loại vắc xin: thông tin về mầm bệnh, con đường lây nhiễm, dịch tễ học.
4.3.2. Một số kỹ thuật thông dụng được sử dụng trong sản xuất vắc xin: Kỹ thuật nuôi tế bào, kỹ thuật gây nhiễm virus, kỹ thuật lên men, kỹ thuật ADN tái tổ hợp, kỹ thuật tách tinh chế protein.
4.3.3. Kiểm tra chất lượng của vắc xin.
4.4. Minh họa một vài qui trình sản xuất vắc xin
4.4.1. Vắc xin sống giảm độc lực (Vắc xin bại liệt uống trên tế bào thận khỉ)
4.4.2. Vắc xin dưới đơn vị (vắc xin viêm gan chế từ huyết thanh người)
4.4.3. Vắc xin bất hoạt tinh chế (vắc xin viêm não Nhật Bản)
4.4.4. Vắc xin tam liên (vắc xin DPT: Bạch hầu, ho gà, uốn ván)
4.4.5. Vắc xin tái tổ hợp (vắc xin viêm gan B tái tổ hợp)

PHẦN 4: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN
3.1. CNSX Ergosterol (vitamin D2).
3.2. CNSX vitamin B12 (riboflavin).
3.3. CNSX vitamin B12 (Cyanocobanamin)
3.4. CNSX beta-caroten và vitamin C.

CHƯƠNG 1
ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH:
Sự phát triển về vi sinh vật học nói chung, và vi sinh vật công nghiệp nói riêng, với bước ngoặc lịch sử là phát minh vĩ đại về chất kháng sinh của Alexander Fleming (1982) đã mở ra kỷ nguyên mới trong y học: khai sinh ra ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh và ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho con người.
Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này một số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác. Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặc tính tổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đối kháng.
Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus subtilis có liên quan đến quá trình hình thành bào tử của loại trực khuẩn này. Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách được từ nấm mốc một chế phẩm có thể sử dụng để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu khuẩn.
Mặc dù vậy, trong thực tế mãi tới năm 1929 thuật ngữ “Chất kháng sinh” mới được Alexander Fleming mô tả một cách đầy đủ và chính thức trong báo cáo chi tiết về penicillin.
Thập kỷ 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những bước tiến vượt bậc của ngành công nghệ sản xuất kháng sinh non trẻ, với hàng loạt sự kiện như:
♦ Khám phá ra hàng loạt Chất kháng sinh, thí dụ như Griseofulvin (1939), gramicidin S (1942) , Streptomycin (1943), bacitracin (1945), cloramphenicol và polymicin (1947), clotetracyclin và Cephalosporin (1948), neomycin (1949), oxytetracyclin và nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954), amphotericin B và Vancomycin (1956), metronidazol, kanamycin và rifamycin (1957)…
♦ Áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến (đặc biệt là các kỹ thuật gây đột biến, kỹ thuật dung hợp tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp gen …) đã tạo ra những biến chủng công nghiệp có năng lực “siêu tổng hợp” các chất kháng sinh cao gấp hàng ngàn vạn lần các chủng ban đầu.
♦ Triển khai thành công công nghệ lên men chìm quy mô sản xuất công nghiệp để sản xuất Penicillin G (1942) và việc hoàn thiện công nghệ lên men này trên các sản phẩm khác.
♦ Việc phát hiện, tinh chế và sử dụng axit 6-aminopenicillanic (6-APA, 1959) làm nguyên liệu để sản xuất các chất kháng sinh penicilin bán tổng hợp đã cho phép tạo ra hàng loạt dẫn xuất penicilin và một số kháng sinh beta-lactam bán tổng hợp khác.
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh:
Chất kháng sinh được hiểu là các chất hoá học xác định, không có bản chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ bien nhất là từ vi sinh vật), với đặc tính là ngay ở nồng độ thấp (hoặc rất thấp) đã có khả năng ức che mạnh mẽ hoặc tiêu diệt được các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo an toàn cho người hay động vật được điều trị.
1.1.2. Cơ chế tác dụng:
Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh (hay các đối tượng gây bệnh khác – gọi tắt là mầm bệnh) của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó; trong đó, những kiểu tác động thường gặp là làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức năng điều tiet quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả quá trình sinh tổng hợp protein, rối loạn quá trình tái bản ADN, hoặc tương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các chuyển hóa trao đổi chất (hình 1.1).

giáo trình công nghệ dược phẩm

1.1.3. Đơn vị kháng sinh:
Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường được biểu thị bằng một trong các đơn vị là : mg/ml, pg/ml, hay đơn vị kháng sinh Ul/ml (hay UI/g, International Unit .
Đơn vị của mỗi kháng sinh được định nghĩa là lượng kháng sinh tối thiểu pha trong một thể tích quy ước dung dịch có khả năng ức che hoàn toàn sự phát triển của chủng vi sinh vật kiểm định đã chọn, thí dụ, với penicillin là số miligam penicillin pha vào trong 50 ml môi trường canh thang và sử dụng Staphylococcus aureus 209P làm chủng kiểm định; với Streptomicin là số miligam pha trong 1 ml môi trường canh thang và kiểm định bằng vi khuẩn Escherichia coli).
1.1.4. Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu:
Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu là đặc tính cho thấy năng lực kìm hãm hay tiêu diệt một cách chọn lọc các chủng vi sinh gây bệnh, trong khi không gây ra các hiệu ứng phụ quá ngưỡng cho phép trên người bệnh được điều trị. Đặc tính này được biểu thị qua hai giá trị là:
Nồng độ kìm hãm tối thiểu (Minimun Inhibitory Concentration – Viết tắt là MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimun Bactericidal Concentration – Viết tắt là MBC), xác định trên các đối tượng vi sinh vật gây bệnh kiểm định lựa chọn tương ứng cho mỗi chất kháng sinh.
1.1.5. Phổ kháng khuẩn của kháng sinh:
Phổ kháng khuẩn của chất kháng sinh biểu thị số lượng các chủng gây bệnh bị tiêu diệt bởi kháng sinh này. Theo đó, chất kháng sinh có thể tiêu diệt được nhiều loại mầm bệnh khác nhau được gọi là chất kháng sinh phổ rộng, chất kháng sinh chỉ tiêu diệt được ít mầm bệnh là chất kháng sinh phổ hẹp.
1.2. Hiện tượng kháng thuốc và bản chất kháng thuốc của vi sinh vật:
Hiện tượng kháng thuốc: Hiện tượng mầm bệnh vẫn còn sống sót sau khi đã điều trị kháng sinh được gọi là hiện tượng kháng thuốc (trên phương diện kiểm nghiệm, vi sinh vật gây bệnh được coi là kháng thuốc nếu nồng độ MIC của chất kháng sinh kiểm nghiệm in vitro trên đối tượng này cao hơn nồng độ điều trị tối đa cho phép đối với bệnh nhân. Có hai dạng kháng thuốc:
Khả năng đề kháng sinh học: Khả năng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh có thể được hình thành ngẫu nhiên trong quần thể, nghĩa là khả năng này đã được hình
thành ở mầm bệnh ngay khi chúng chưa tiếp xúc với môi trường chứa chất kháng sinh. Dạng kháng thuốc này được gọi là khả năng đề kháng sinh học. Nguyên nhân của hiện tượng này có thể do đột biến ngẫu nhiên trong nhiễm sắc thể làm trong quần thể vi sinh vật gây bệnh xuất hiện các tế bào (hay thâm chí chỉ cần một vài tế bào) có khả
năng kháng thuốc. Do đó, khi bệnh nhân được điều trị kháng sinh trong một thời gian nhất định thì chỉ có các tế bào thường bị tiêu diệt, còn các tế bào kháng thuốc này vẫn còn sống sót, tiếp tục sinh trưởng phát triển dần bù đắep cho cả số tế bào đã bị tiêu diệt. Kết quả làm thay đổi hoàn toàn bản chất vi sinh của bệnh và vô hiệu hóa tác dụng điều trị của thuốc kháng sinh đó.
Khả năng đề kháng điều trị: Khả năng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh thường xuất hiện phổ biến hơn nhiều sau khi chúng đã tiếp xúc với kháng sinh, vì vậy trường hợp này còn được gọi là khả năng đề kháng điều trị. Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong tế bào vi sinh vật có chứa các yếu tố kháng thuốc R tiềm ẩn (Resistance Factor). Yếu tố kháng thuốc R có bản chất plasmid. Khi vi sinh vật sống trong môi trường có kháng sinh, các plasmid kháng thuốc của chúng sẽ được hoạt hoá, tự sao chép tổng hợp ra vô số plasmid mới. Chính hoạt tính của các plasmid này sẽ làm tăng sức đề kháng cho tế bào chủ, nhờ vậy chúng vẫn có thể tồn tại và phát triển trong môi trường có kháng sinh. Do có bản chất plasmid nên các yếu tố kháng thuốc R này rất dễ dàng vận chuyển qua lại giữa các loài gần gũi nhau qua biến nạp, tải nạp hay tiếp hợp.

Nguyên nhân hiện tượng kháng thuốc:
– Việc sử dụng cùng loại kháng sinh kéo dài hoặc lạm dụng thuốc kháng sinh (tuỳ tiện sử dụng thuốc không đúng liều lượng, không đúng chỉ định và không đủ thời gian cần thiết) đã vô tình tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh cho các chủng vi sinh vật có khả năng kháng thuốc, đồng thời trở thành liệu pháp kích thích các chủng kháng thuốc này tổng hợp ra vô số plasmid mới.
– Xu thế sử dụng tuỳ tiện chất kháng sinh trong chăn nuôi, đặc biệt là bổ sung vào khi chế biến thức ăn gia súc, gia cầm nuôi lấy thịt, trứng, sữa … Khi đó, ngoài các tác dụng có lợi dự kiến, chính chất kháng sinh bổ sung sẽ tạo ra môi trường phát triển chọn lọc cho các chủng mang yếu tố kháng thuốc R trên động vật nuôi. Khi sử dụng thịt, trứng, sữa … của chúng làm nguyên liệu chế biến, các chủng kháng thuốc này sẽ kéo theo vào trong các sản phẩm thực phẩm. Kết quả khi người tiêu dùng sử dụng các thực phẩm này, một mặt họ phải tiếp nhận phần dư lượng kháng sinh trong sản phẩm; nhưng mặt khác, nguy hiểm hơn là các loại vi sinh vật kháng thuốc trong các sản phẩm thực phẩm thuộc nhóm này có ưu thế tồn tại, phát triển cao hơn và các plasmid kháng thuốc của chúng lại đang ở trong trạng thái hoạt hoá.
Cơ chế của sự kháng thuốc: Cơ chế của sự kháng thuốc rất đa dạng và thường khác nhau đối với từng chủng vi sinh vật:
* Một số loài vi sinh vật có khả năng kháng thuốc tự nhiên với một số kháng sinh nhất định, do thuốc này không tác động lên chúng ( thí dụ như: nấm, virus, nguyên sinh động vật, do trên thành tế bào không có lớp peptidoglucan nên không chịu tác động của các kháng sinh beta – lactam).
* Một số chủng vốn nhạy cảm với chất kháng sinh trở nên kháng thuốc khi chúng thu nhận được một trong các đặc tính mới như:
Có khả năng vô hoạt hay phá hủy chất kháng sinh (bằng cách tổng hợp ra các enzym ngoại bào làm phá vỡ cấu trúc của chất kháng sinh hay liên kết với chất kháng sinh để tạo ra dạng kém hiệu lực kháng sinh hơn).
Có thể tự điều chỉnh khả năng hấp thụ của màng tế bào chất làm giảm hoặc ngăn ngừa chất kháng sinh xâm nhập vào tế bào chất.
Có khả năng làm biến đổi cấu trúc phân tử của nơi hoặc vị trí mà chất kháng
sinh tác dụng vào
Tự điều chỉnh thay đổi đường hướng trao đổi chất để vô hiệu hóa tác dụng của chất kháng sinh đó…
Hiện tượng kháng chéo: Bên cạnh hai hiện tượng kháng thuốc nêu trên, trong thực tiễn còn tồn tại hiện tượng kháng chéo (hay kháng nhóm), nghĩa là một chủng khi đã kháng lại chất kháng sinh nhất định thì chúng cũng có khả năng kháng luôn một số chất kháng sinh khác cùng nhóm cấu trúc hay có các đặc tính tương đồng với chất kháng sinh ấy, thí dụ như một số chủng vi sinh vật gây bệnh đã kháng được penicillin thì cũng có trường hợp kháng luôn nhiều kháng sinh beta – lactam khác.
Khắc phục hiện tượng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh: giải pháp trực quan và đơn giản là sử dụng các dạng kháng sinh mới. Tuy nhiên, việc tìm kiếm, phát hiện và sản xuất một kháng sinh mới là cả một khối lượng công việc khổng lồ, tiêu tốn rất nhiều thời gian, nhân lực và tiền bạc
Trước hết cần triệt để tôn trọng ba nguyên tắc sử dụng thuốc kháng sinh là:
♦ Chỉ định điều trị kháng sinh đúng (làm kháng sinh đồ để chọn đúng kháng sinh thích hợp để chỉ định điều trị; dùng thuốc đúng liều, đúng phác đồ, đủ thời gian điều trị; chú ý phát hiện sớm dấu hiệu kháng thuốc);
♦ Không lạm dụng kháng sinh khi chưa cần thiết (không lạm dụng “điều trị phòng ngừa” bằng thuốc kháng sinh, nghiêm cấm bệnh nhân tự chỉ định điều trị thuốc kháng sinh thay bác sĩ);
♦ Nghiêm cấm sử dụng tràn lan chất kháng sinh trong chăn nuôi và giám sát chặt chẽ việc sử dụng kháng sinh trong thú y.

1.3. ĐIỀU CHỈNH SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH:
Cũng như với tất cả quá trình lên men khác, việc điều chỉnh sinh tổng hợp chất kháng sinh trên nguyên tắc có thể được thực hiện qua hàng loạt cơ chế khác nhau, thí dụ, cơ chế cảm ứng, cơ chế kiềm toả, cơ chế ức chế ngược …Trong thực tiễn cần phải phối hợp hàng loạt các giải pháp khoa học và công nghệ, cụ thể có thể phân chia thành hai nhóm lớn là:
♦ Tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng hợp chất kháng sinh;
♦ Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vân hành quá trình lên men.
1.3.1. Tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng hợp chất kháng sinh:
Đây là thành quả của sự phối hợp đồng bộ hàng loạt giải pháp kỹ thuật tuyển chọn giống và tạo chủng tiên tien như: kỹ thuật gây đột biến, kỹ thuật dung hợp tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp và các giải pháp kỹ thuật gen khác
Nhìn chung, quá trình tuyển chọn tạo chủng công nghiệp siêu tổng hợp kháng sinh cũng thường trải qua sáu giai đoạn cơ bản là:
– Phân lập từ thiên nhiên.
– Nghiên cứu xử lý tạo các biến chủng “Siêu tổng hợp” có hoạt lực cao.
– Tuyển chọn sơ bộ.
– Tuyển chọn lại thu các chủng có hoạt tính cao quy mô phòng thí nghiệm.
– Thử nghiệm và tuyển chọn lại trên quy mô sản xuất thử nghiệm pilot.
– Thử nghiệm và chọn lọc lại các chủng phù hợp với điều kiện lên men sản xuất lớn công nghiệp.
Trong các giai đoạn trên, bước tuyển chọn lại quy mô phòng thí nghiệm là công đoạn tuyển chọn toàn diện và kỹ lưỡng nhất;
Mục tiêu của quá trình tuyển chọn tạo bien củng công nghiệp không chỉ dừng lại ở năng lực siêu tổng hợp kháng sinh của chủng, mà còn định hướng đồng thời vào các mục tiêu khác như: tạo ra các bien chủng tích tụ ít các sản phẩm không mong muốn, các biến chủng tổng hợp ra các sản phẩm hoàn toàn mới (nhất là các sản phẩm có cấu trúc và đặc tính mong muốn theo “thiết kế” của con người), các biến chủng rất nhạy cảm với chất kháng sinh hay các chủng có sức đề kháng cao với những chất kháng sinh nào đó …. Việc tuyển chọn và tạo chủng công nghiệp là công việc lâu dài và tiêu tốn rất nhiều nhân lực, đòi hỏi phải được tiến hành nghiêm túc, liên tục và thường xuyên.
1.3.2. Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành quá trình lên men:
– Việc tối ưu hóa thành phần môi trường lên men có vai trò rất quan trọng, quyết định năng lực và hiệu quả chung của toàn quá trình: xác định nguồn nguyên liệu chính, thành phần môi trường lên men, nồng độ tương ứng của từng cấu tử trong từng
thời điểm cụ thể, đều được xác định qua con đường thực nghiệm, trên cơ sở kiểm tra trên hàng loạt cơ chất dự kiến chính, các tiền chất, các chất dinh dưỡng khác, các chất phụ gia kỹ thuật…
. Nguồn thức ăn cacbon thường được lựa chọn là: các loại bột và hạt ngũ cốc,
cám mỳ, cám gạo, vỏ khoai tây, rỉ đường, các loại đường ( glucoza, fructoza, maltoza, lactoza …) dextrin, glycerin, axit axetic, manit, các loại rượu, dịch thủy phân gỗ, nước thải hồ sunfit.
. Nguồn thức ăn nitơ có thể là: bột đậu tương, nước chiết ngô, cao nấm men, nước chiết nấm nem, pepton, các muối NO3″, NH4+…
Các nguyên tố khoáng đa lượng thường gặp như: photpho, lưu huỳnh, ma nhê, sắt, canxi, kali, natri; các nguyên tố vi lượng như: đồng, kẽm, coban, molipden… và các chất sinh trưởng..
. Việc thay đổi thành phần môi trường, nồng độ các cấu tử và sự biến thiên nồng độ của chúng trong suốt quá trình có quan hệ chặt chẽ với hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật, vì vậy quan hệ chặt chẽ đến các sản phẩm tạo thành của quá trình.
– Ngoài ra, trong quá trình lên men, người ta còn khai thác hiệu quả tác động của các yếu tố khác trong môi trường như: nhiệt độ lên men tối ưu, pH, nồng độ oxy, thế oxy hóa khử, cường độ sục khí, cường độ khuấy trộn dịch lên men ..
Như vậy hiệu quả sinh tổng hợp sản phẩm thu được bao giờ cũng là kết quả của sự phối hợp tác dụng của tất cả các yếu tố, các điều kiện trang thiết bị công nghệ cấu thành nên công nghệ lên men các sản phẩm đó.

CHƯƠNG 2
CÔNG NGHỆ LÊN MEN KHÁNG SINH PENICILLIN
2.1. ĐIỂM LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ SẢN XUẤT PENICILLIN
– Phát hiện tình cờ vào năm 1928 do Alexander Fleming, khi nhận thấy một hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện hiện tượng vòng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm.
Ông đã sử dụng ngay tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh này (1929).
Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931). Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nỗ lực nhằm tách và tinh chế penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh của chế phẩm tinh chế và do đó vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên.
Năm 1938 ở Oxford, khi tìm lại các tài liệu khoa học đã công bố, Ernst Boris Chain quan tâm đến phát minh của Fleming và ông đã đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu này. Ngày 25/05/1940 penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên chuột.
1942: đã tuyển chọn được chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL 1951 (1943) và sau đó đã được biến chủng P. chrysogenum Wis Q – 176 (chủng này được xem là chủng gốc của hầu hết các chủng công nghiệp đang sử dụng hiện nay trên toàn thế giới); đã thành công trong việc điều chỉnh đường hướng quá trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 1944)….

giáo trình công nghệ dược phẩm

 

Hình 2.1. Các tác giả giải thưởng Nobel y học năm 1945 về công trình penicillin

Penicillin được xem là loại kháng sinh phổ rộng, được ứng dụng rộng rãi trong điều trị và được sản xuất ra với lượng lớn nhất trong số các chất kháng sinh đã được biết hiện nay. Chúng tác dụng lên hầu hết các vi khuẩn Gram dương và thường được chỉ định điều trị trong các trường hợp viêm nhiễm do liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ như viêm màng não, viêm tai – mũi – họng, viêm phế quản, viêm phổi, lâu cầu, nhiễm trùng máu…Thời gian đầu penicillin được ứng dụng điều trị rất hiệu quả. Tuy nhiên, chỉ vài năm sau đã xuất hiện các trường hợp kháng thuốc và hiện tượng này ngày càng phổ biến hơn.
Vì vậy 1959, Batchelor và đồng nghiệp đã tách ra được axit 6-aminopenicillanic. Đây là nguyên liệu để sản xuất ra hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác nhau. Ngày nay trên thế giới đã sản xuất ra được trên 500 chế phẩm penicillin (trong đó chỉ lên men trực tiếp hai sản phẩm là penicillin V và penicillin G) và tiếp tục triển khai để sản xuất các chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác.

giáo trình công nghệ dược phẩm

2.2. CƠ SỞ CÔNG NGHỆ SINH TỔNG HỢP PENICILLIN NHỜ NẤM MÓC:
2.2.1. Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P. chrysogenum:
Vào những năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường sử dụng các
chủng có hoạt lực cao thuộc loài P. notatum và P. baculatum. Nhưng từ khi trường đại học Wisconsin (Mỹ) phân lập được chủng P.chrysogenum có hoạt tính cao hơn thì chủng này dần dần đã thay the và từ khoảng sau những năm 50 của the kỷ XX đen nay tất cả các công ty sản xuất penicillin trên the giới đều sử dụng các bien chủng P.chrysogenum công nghiệp.
– Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản xuất penicillin trên nguyên tắc cũng trải qua sáu giai đoạn cơ bản đã mô tả trong mục 1.3.1, trong đó giải pháp kỹ thuật đã được áp dụng hiệu quả để thu nhận bien chủng “siêu tổng hợp”
penicillin lại chính là các kỹ thuật gây đột bien thường như: xử lý tia Rơn – ghen, xử lý tia cực tím và tạo đột bien bằng hoá chất, thí dụ như Metylbis – amin (metyl -2-^-clo- etylamin), N-mustar (tris – P-clo- etylamin), Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat, 1,2,3,4 -diepoxybutan.
2.2.2. Cơ chế sinh tổng hụp penicillin ở nấm mốc P. chrysogenum:
Theo quan điểm phổ bien hiện nay, quá trình sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P. chrysogenum có thể tóm tắt như sau: từ ba tiền chất ban đầu là a-aminoadipic, cystein và valin sẽ ngưng tụ lại thành tripeptit ỏ-(a- aminoadipyl) – cysteinyl – valin ; tiếp theo là quá trình khép mạch tạo vòng P-lactam và vòng thiazolidin để tạo thành izopenicillin-N; rồi trao đổi nhóm a-aminoadipyl với phenylacetic (hay phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm penicillin G (hay penicillin V, xem sơ đồ tổng hợp penicillin G trong hình 2.3.

 

 

Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp penicillin từ axit L-a- aminoadipic, L- cystein và L-valin

Hình 2.3. Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp penicillin từ axit L-a- aminoadipic, L- cystein và L-valin
Trong 3 axit amin tiền chất trên thì cystein có thể được tổng hợp bằng một trong ba con đường là được tổng hợp từ xerin (hình 2.4), từ homoxerin với việc tuần hoàn chuyển hóa a-cetobutyrat qua oxaloacetat (hình 2.5), hay từ homoxerin với sự chuyển hóa a- cetobutyrat qua izolecin. Đồng thời a- aminoadipic được giải phóng ra trong sơ đồ hình 2.6 có thể được tuần hoàn để tham gia quá trình ngưng tụ ban đầu.

Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp cystein từ xerin

Hình 2.4. Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp cystein từ xerin

Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp cistein từ homoxerin với sự biến đổi a- cetobutyrat thành oxaloacetat

Hình 2.5. Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp cistein từ homoxerin với sự biến đổi a- cetobutyrat thành oxaloacetat

Tuy nhiên, cũng có thể nó được giải phóng ra và tích tụ trong môi trường (vì trong quá trình lên men sản xuất penicillin V bao giờ cũng phát hiện thấy trong dịch lên men lượng lớn a- aminoadipic dạng vòng). Như vây, quá trình sinh tổng hợp penicillin, phụ
thuộc vào điều kiện lên men cụ thể nhất định, có thể xảy ra theo sáu đường hướng
khác nhau. Do đó, hiệu suất chuyển hoá cơ chất – sản phẩm cũng biến đổi và phụ thuộc vào đường hướng sinh tổng hợp tương ứng. Theo lý thuyết thì hiệu suất lên men sẽ trong khoảng 683 – 1544 UI penicillin/g glucoza; song, trong thực tế, với những chủng có hoạt tính sinh tổng hợp cao nhất cũng mới chỉ đạt khoảng 200 UI/g glucoza.

Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp a- aminoadipic

Hình 2.6. Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp a- aminoadipic

Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp valin

2.2.3. Tác động của các thông số công nghệ đến quá trình sinh tổng hợp penicillin.
2.2.3.1. Sự phát triển hệ sợi và đặc điểm hình thái hệ sợi nấm:
Sự phát triển hệ sợi nấm trong quá trình lên men bao gồm:
– Sự tăng trưởng về kích thước hệ sợi (tăng độ dài sợi, sự lớn lên về kích thước, mức
độ phân nhánh của hệ sợi … )
– Sự biến thiên về sổ lượng khóm sợi nấm trong môi trường: Thông thường, sự phát triển này được đánh giá qua hai chỉ tiêu là: hàm lượng sinh khối và tốc độ biến thiên hàm lượng sinh khối trong môi trường. Hai chỉ tiêu này có thể xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như: hàm lượng sinh khối (Sinh khối tươi hoặc sinh khối
khô), mật độ quang dịch lên men, trở lực lọc của dịch lên men, hàm lượng nitơ, hàm lượng hydratcacbon, hàm lượng axit nucleic … Trong các phương pháp trên, được áp dụng phổ biến hơn cả trong sản xuất công nghiệp là phương pháp xác định qua hàm lượng sinh khối.
Tốc độ phát triển hệ sợi nấm phụ thuộc hàng loạt các yếu tố khác nhau trong quá trình lên men và sự tích tụ penicillin thường xảy ra mạnh mẽ khi hệ sợi phát triển đạt trạng thái cân bằng. Trạng thái này có thể xác lập được khi chỉ cung cấp vừa đủ và liên tục lượng thức ăn tối thiểu cho nấm mốc. Thiếu thức ăn, hệ sợi nấm sẽ tự phân, còn nếu cung cấp quá nhu cầu trên, hệ sợi sẽ phát triển, nhưng không tích tụ mạnh
penicillin mà tích tụ nhiều axit gluconic và axit malic.
Đặc điểm hình thái và cấu trúc hệ sợi nấm: Trong quá trình lên men, do nhiều nguyên nhân khác nhau, số lượng khóm sợi nấm bao giờ cũng có xu hướng tăng lên, ngay cả trong quá trình lên men tĩnh. Trong điều kiện lên men có sục khí và khuấy trộn, do tác dụng va đập cơ học với cánh khuấy và các chuyển động dòng xoáy trong môi trường, một mặt sự đứt gãy hệ sợi nấm xảy ra nhiều hơn và hệ sợi nấm bao giờ cũng có xu hướng vón cuộn lại thành cấu trúc búi sợi cuộn xoắn, được gọi là pellet.
♦ Pellet xổp (fluffy loose pellets) là dạng pellet có phần bên trong hệ sợi cuộn thành khối chắc và mịn, lớp sợi phía bên ngoài cuộn lỏng lẻo tạo thành cấu trúc xốp hơn.
♦ Pellet chắc và mịn (compact smooth pellets) có đặc điểm là phần sợi phía bên trong pellet cuộn tương đối chặt chẽ ra đến gần sát lớp sợi phía ngoài, lớp sợi phía ngoài cùng cũng cuộn đủ chắc thành lớp sợi mịn.
♦ Pellet rỗng (hollow pellets) là dạng pellet có phần sợi bên trong bị tự phân tạo thành khoảng rỗng, hệ sợi phía bên ngoài cuộn rất chặt thành lớp sợi mịn và chắc chắn.
– Hiệu quả chung của quá trình lên men có quan hệ hữu cơ với số lượng, kích thước và cấu trúc pellet nấm. Trong thực tiễn sản xuất công nghiệp, người ta thường điều chỉnh các thông số công nghệ theo hướng ưu tiên tạo ra dạng pellet đủ nhỏ và min, hạn che tạo pellet xốp và ngăn ngừa hình thành các pellet rỗng. Điều kiện công nghệ tương ứng với mục tiêu trên thường áp dụng là : tỉ lệ cây giống 10%, với mật độ dịch giống (2-10).10n bào tử /m3; phối hợp điều chỉnh giữa sục khí và khuấy trộn để đảm bảo cung cấp oxy hòa tan dư so với nhu cầu tương ứng với thời điểm lên men, và để tạo ra pellet mịn và nhỏ (kích thước pellet thích hợp nhất khoảng 0,2 – 0,5mm), trong điều kiện đã cân đối với nhu cầu tiet kiệm mức tiêu tốn năng lượng do khuấy trộn.
2.2.3.2. Đặc tính nhiệt động của dịch lên men:
Trong các thiet bị lên men dung tích lớn có sục khí và khuất trộn, thực te không thể xác lập được sự đồng đều tại khắp các vùng thể tích làm việc của thiet bị. Tại các
vùng chảy rối (vùng gần cánh khuấy), tốc độ trao đổi nhiệt, tốc độ chuyển khối xảy ra mạnh mẽ hơn. Còn tại các vùng chảy màng (vùng sát thành thiết bị, vùng gần các ống xoắn trao đổi nhiệt, vùng kém hiệu quả hay vùng chet của thiet bị…) tốc độ chuyển khối hay tốc độ truyền nhiệt cũng giảm đi. Ngoài ra, tại những khu vực nhất định của thiết bị có thể xuất hiện vùng xoáy cục bộ hay các dòng chảy thứ cấp làm thieu hụt về hàm lượng oxy hòa tan.
Các yếu tố nêu trên đây sẽ tác động trực tiếp đến năng lực sinh tổng hợp của chủng, hiệu quả chuyển hóa tạo sản phẩm và hiệu quả kinh tế chung của toàn quá trình lên men. Thực tế thường chọn chế độ khuấy trộn dư trên mức yêu cầu.
2.2.3.3. Thành phần môi trường lên men:
Môi trường cơ sở để lên men penicillin, vào thời kỳ đầu trong những năm 40 – 50, là môi trường lactoza – nước chiết ngô, với thành phần chính nêu trong bảng 2.1.
Nguồn cơ chất chính: là lactoza có thể được thay thế từng phần hoặc toàn bộ bằng các cơ chất khác như: các loại đường hexoza, đường pentoza, disaccarit, dextrin hay thay thế bằng dầu thực vật. Trong các cơ chất nêu trên, hiệu quả cao hơn cả vẫn là glucoza.
Ngoài ra, khi sử dụng dầu thực vật làm chất phá bọt phải xét đến hiệu ứng nấm mốc sử dụng một phần dầu thực vật làm nguồn cung cấp thức ăn cacbon, để tính toán điều chỉnh nồng độ glucoza trong môi trường lên men (và cả sự cản trở quá trình chuyển khối do ảnh hưởng của dầu phá bọt).
Nguồn cung cấp thức ăn nitơ: có thể sử dụng là bột đậu tương, bột hạt bông, các loại dầu cám. Nhu cầu về thức ăn nitơ cũng có thể được đáp ứng bằng cách cung cấp liên tục (NH4)2SO4, nhưng duy trì ở nồng độ thấp, khoảng 250 – 340g/l (nếu dư
thừa hiệu quả sinh tổng hợp penicillin sẽ giảm, nếu thiếu sẽ xảy ra hiện tượng tự phân hệ sợi) .
Hàm lượng các chất khoáng bổ sung: được tính toán, phụ thuộc vào lượng dịch chiết ngô sử dụng;
pH môi trường được điều chỉnh trước khi thanh trùng, sau đó trong suốt quá trình lên men được giám sát chặt chẽ và điều chỉnh theo yêu cầu công nghệ.
Nồng độ tiền chất tạo nhánh:Trong quá trình sinh tổng hợp penicillin, việc kết gắn mạch nhánh của phân tử penicillin không mang tính đặc hiệu chặt chẽ. Nhờ vây, nếu duy trì nồng độ tiền chất tạo nhánh cần thiết phenylacetat (hoặc phenooxyacetat) sẽ cho phép thu nhân chủ yếu một loại penicillin G trong dịch lên men (hoặc penicillin V). Theo lý thuyết, nhu cầu về phenylaceta là 0,47g/gam penicillin G (hoặc phenooxyacetat là 0,50g/gam penicillin V ). Cần chú ý cả hai cấu tử trên thực chất đều gây độc cho nấm nên người ta thường lựa chọn giải pháp bổ sung liên tục cấu tử này
và khống chế chặt chẽ nồng độ theo yêu cầu, để không làm suy giảm năng lực lên men của chủng sản xuất.
Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men cơ bần để lên men sần xuất penicillin
• Lactoza 20-50kg/m3
• Glucoza 0-10kg/ m3, bổ sung gián đoạn hoặc liên tục trong quá trình lên men
• Dịch chiết ngô cô đặc 15-50kg/ m3
• Các khoáng chất
NaN03 0-5kg/ m3 Na2S04 0- lkg/ m3
CaC03 0-1 Okg/ m3 KH2P04 0-4kg/ m3
MgS04.7H20 0-0,25kg/m3 MgS04 0-0,02kg/ m3 ZnS04 0-0,04kg/ m3
• Tiền chất tạo nhánh (phenylacetic hoặc dẫn xuất) bổ sung liên tục theo nhu cầu
• Chất chống tạo bọt bổ sung liên tục theo nhu cầu
2.2.3.4. Điều kiện tiến hành lên men:
Nhiệt độ là thông số có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của nấm mốc, khả năng sinh tổng hợp và năng lực tích tụ penicillin của chúng. Nhìn chung nấm mốc phát triển thuận lợi hơn ở dải nhiệt độ khoảng 300C. Tuy nhiên, ở ở dải nhiệt độ này tốc độ phân huỷ penicillin cũng xảy ra mạnh mẽ. Trong thực tế, ở giai đoạn nhân giống sản xuất người ta thường nhân ở dải nhiệt độ 300C; sang giai đoạn lên men thường áp dụng một trong hai chế độ nhiệt là :
♦ Lên men ở một dải nhiệt độ: Thường duy trì nhiệt độ trong suốt quá trình lên men ở dải nhiệt độ 25 – 270C.
♦ Lên men ở hai chế độ nhiệt độ: Giai đoạn lên men bắt đầu tiến hành ở 300C cho đến khi hệ sợi phát triển đạt yêu cầu về hàm lượng sinh khối thì điều chỉnh nhiệt độ sang chế độ lên men penicillin ở dải nhiệt độ 22 – 250C (có công nghệ điều chỉnh xuống 22 – 230C, giữ ở nhiệt độ này tiếp hai ngày rồi chuyển sang lên men tiếp ở 250C cho đến khi kết thúc quá trình lên men).
pH môi trường thuận lợi cho sự phát triển hệ sợi và cho quá trình sinh tổng hợp penicillin thường dao động trong khoảng pH = 6,8 – 7,4. Tuy nhiên ở điều kiện pH cao xu hướng phân huỷ penicillin cũng tăng lên. Vì vậy, trong sản xuất pH môi trường
thường được khống chế chặt chẽ ở giá trị lựa chọn trong khoảng pH = 6,2 – 6,8.
Nồng độ oxy hoà tan và cường độ khuấy trộn dịch lên men: Với nhiều chủng nấm mốc, nồng độ oxy hòa tan thuận lợi cho quá trình sinh tổng hợp penicillin dao động quanh mức 30% nồng độ oxy bão hòa.
Nồng độ CO2 trong dịch lên men ở mức nhất định cũng cần thiết cho quá trình nảy mầm của bào tử nấm mốc; tuy nhiên nếu nồng độ CO2 quá cao sẽ làm cản trở quá trình hấp thu và chuyển hoá cơ chất của chủng, nghĩa làm làm cản trở quá trình sinh tổng hợp penicillin.
2.2.3.5. Sự tích tụ và phân huỷ penicillin:
Trong quá trình lên men, do nhiều nguyên nhân khác nhau, trong đó có ảnh hưởng của nồng độ penicillin tích tụ trong môi trường ngày càng tăng, làm cho năng lực sinh tổng hợp penicillin của chủng có xu hướng giảm dần theo thời gian lên men.
Đồng thời, phụ thuộc vào nhiệt và pH môi trường, một phần lượng penicillin đã tích tụ cũng bị phân huỷ theo thời gian.
Nhằm giảm tổn thất trên, ngay sau khi kết thúc quá trình lên men cần xử lý thu sản phẩm sớm hoặc có giải pháp hạ thấp nhanh nhiệt độ dịch lên men.

2.3. QUY TRÌNH LÊN MEN SẢN XUẤT PENICILLIN TRONG CÔNG NGHIỆP:
2.3.1. Đặc điểm chung:
Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng của từng cơ sở sản xuất và các thông tin này rất hạn chế cung cấp công khai, ngay mỗi bằng sáng chế thường cũng chỉ giới hạn ở những công đoạn nhất định; vì vậy rất khó đưa ra được công nghệ tổng quát chung. Theo công nghệ lên men của hãng Gist-Brocades (Hà Lan), toàn bộ dây chuyển sản xuất thuốc kháng sinh penicillin có thể phân chia làm bốn công đoạn chính như sau (xem sơ đồ hình 2.8)
♦ Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hoặc penicillin G) .
♦ Xử lý dịch lên men tinh che thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên.
♦ Sản xuất các penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên)
♦ Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại.

Sơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin (theo Gist-Brocades Copr. (Hà Lan))

2.3.2. Chuẩn bị lên men:
Giống, bảo quản và nhân giống cho sản xuất: Giống công nghiệp P.chrysogenum được bảo quản lâu dài ở dạng đông khô, bảo quản siêu lạnh ở 700C hoặc bảo quản trong nitơ lỏng. Giống từ môi trường bảo quản được cấy chuyền ra trên môi trường thạch hộp để hoạt hoá và nuôi thu bào tử. Dịch huyền phù bào tử thu từ hộp petri được cấy chuyển tiep sang môi trường bình tam giác, rồi sang thiet bị phân giống nhỏ, qua thiết bị nhân giống trung gian … và cuối cùng là trên thiet bị nhân giống sản xuất. Yêu cầu quan trọng của của công đoạn nhân giống là phải đảm bảo cung cấp đủ lượng giống cần thiet, với hoạt lực cao, chất lượng đảm bảo đúng thời điểm hco các công đoạn nhân giống ke tiếp và cuối cùng là cung cấp đủ lượng giống đạt các yêu cầu kỹ thuật cho lên men sản xuất. Trong thực tiễn, để đảm bảo cho quá trình lên men thuận lợi người ta thường tính toán lượng giống cấp sao cho mật độ giống trong dịch lên men ban đầu khoảng 1 – 5.109 bào tử / m3.
Thành phần môi trường nhân giống cần được tính toán để đảm bảo cung cấp đủ nguồn thức ăn C, N, các chất khoáng và các thành phần khác, đảm bảo cho sự hình thành và phát triển thuận lợi của pellet.
Chuẩn bị môi trường lên men và thiết bị:
– Chuẩn bị môi trường lên men:
. Cân đong, pha chế riêng rẽ các thành phần môi trường lên men trong các thùng
chứa phù hợp
. Thanh trùng gián đoạn ở 1210C ( hay thanh trùng liên tục ở khoảng 140-1460C) hoặc lọc qua các vật liệu siêu lọc rồi mới bơm vào thùng lên men.
Nếu đặc tính công nghệ của thiết bị lên men cho phép, có thể pha chế rồi thanh trùng đồng thời dịch lên men trong cùng một thiết bị. Tất cả các cấu tử bổ sung vào môi trường lên men đều phải được xử lý khử khuẩn trước và sau đó bổ sung theo chế độ vận hành vô khuẩn.
– Thiết bị lên men: Phải được vô khuẩn trước khi đưa vào sử dụng. Thường thanh trùng bằng hơi quá nhiệt 2,5 – 3,0 at trong thời gian 3 giờ. Đông thời khử khuẩn nghiêm ngặt tất cả các hệ thống ống dẫn, khớp nối, van, phin lọc và tất cả các thiết bị phụ trợ khác.. . Trong quá trình lên men luuôn cố gắng duy trì áp suất dư trong thiết bị nhằm hạn chế rũi ro do nhiễm tạp.
– Không khí thường được khử khuẩn sơ bộ bằng nén đoạn nhiệt, sau đó qua màng lọc vô khuẩn hay màng siêu lọc .
2.3.3. Kỹ thuật lên men:
2.3.3.1. Kỹ thuật lên men bề mặt:
Áp dụng từ lâu, hiện nay hầu như không còn được triển khai trong sản xuất lớn nữa. Gồm 2 phương pháp:
* Lên men trên nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngô có bổ sung đường lactoza)
* Lên men trên bề mặt môi trường lỏng tĩnh (phổ biến sử dụng môi trường cơ bản lactoza- nước chiết ngô)..
Do đường lactoza được nấm mốc đồng hóa chậm nên không xảy ra hiện tượng dư thừa đường trong tế bào. Còn dịch nước chiết ngô cung cấp cho nấm mốc nguồn thức ăn nitơ, các chất khoáng và các chất sinh trưởng, trong đó phenylalanin khi bị thủy phân sẽ tạo thành phenylacetic cung cấp tiền chất tạo mạch nhánh cho phân tử penicillin.
Khi lên men trong môi trường lỏng, áp dụng công nghệ bổ sung liên tục phenylacetic vào môi trường lên men, hàm lượng bổ sung phụ thuộc pH môi trường thường là 0,2-0,8 kg phenylacetic/m3 dịch lên men.Trong điều kiện đó, lượng penicillin G được tổng hợp tăng rõ rệt còn hàm lượng các penicillin khác cũng giảm đi. Để hạn chế quá trình oxy hóa tiền chất, thường phải bổ sung vào môi trường một lượng nhỏ axit axetic. Trong kỹ thuật lên men lỏng gián đoạn không điều chỉnh pH môi trường thường tăng nhẹ, sau đó tương đối ổn định và vào cuối quá trình lên men thường trong khoảng pH = 6,8-7,4. Khi sử dụng cơ chất chính là lactoza, người ta đã xác định được penicillin chie được tổng hợp và tích tụ mạnh mẽ trong môi trường khi nấm mốc đã sử dụng đường này và khi lactoza có dấu hiệu cạn kiệt thì sợi nấm cũng bắt đầu tự phân. Vì vậy người ta thường kết thúc quá trình lên men vào thời điểm sắp hết đường lactoza.
2.3.3.2. Kỹ thuật lên men chìm:
Kỹ thuật lên men chìm là kỹ thuật được áp dụng trong hầu hết các cơ sở sản xuất penicillin công nghiệp hiện nay và thường được vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hay bán liên tục) một hay một vài cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại một phần hệ sợi của mẻ lên men trước (hoặc không). Quá trình lên men được vận hành theo phương pháp lên men hai pha, với pha đầu nuôi thu sinh khối trong khảng 2-3 ngày, sau đó chuyển sang pha lên men thu sản phẩm. Trong hầu hết các trường họp người ta thay thế phần lớn (hoặc hoàn toàn) đường lactoza bằng đường glucoza. Lượng glucoza này có thể được bổ sung liên tục hay bán liên tục nhưng phải giám sát chặt chẽ nồng độ glucoza trong suốt quá trình vận hành pha sau để duy trì nồng độ glucoza luôn ở mức thích hợp nhằm vừa giữ khối lượng hệ sợi ổn định, vừa đảm bảo sinh tổng hợp nhiều penicillin. Trong thực tiễn, để tránh xảy ra thiếu hụt nhất thời glucoza người ta có thể kết hợp bổ sung lượng nhỏ đường lactoza (khi đó, nếu chưa bổ sung kịp glucoza thì nấm mốc sẽ tự điều chỉnh để sử dụng đường lactoza nên không xảy ra hiện tương tự phân hệ sợi). Ngoài nguồn nitơ trong nước chiết ngô, người ta thường sử dụng phối hợp (NH4)2S04 để vừa cung cấp thức ăn N và s, vừa sử dụng đê điều chỉnh pH trong quá trình lên men (pH dịch lên men ban đầu thường được điều chỉnh về khoảng pH=ố,5- 6,8; bằng dung dịch NaOH hoặc H3PO4); nồng độ NH4+ thường khống chế trong khoảng 0,3-0,4kg/m’ dịch lên men. Chất phá bọt thường sử dụng là các loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, dầu cám… Tiền chất tạo nhánh phenylacetic trong lên men sản xuất penicillin G (hoặc phenooxyacetic trong lên men sản xuất penicillin V) được bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) trong suốt thời gian pha lên men penicillin, để duy trì nồng độ trong khoảng 0,l-l,0kg/m3 dịch (nếu ít quá nấm mốc sẽ tổng hợp đổng thời nhiều penicillin khác, nếu nhiều quá sẽ gây độc cho nấm và tăng cường thúc đẩy quá trình hydroxyl hóa sản phẩm penicillin). Nhiệt độ lên men pha đầu khống chế ở 30 độ C, sau đó sang pha sau giữ ở 22-25 độ C. Tốc độ sục khí và khuấv trộn được điều chinh để duy trì nồng độ oxy hòa tan trong dịch trong khoảng 30%. Trong điều kiện trên thời gian lên men mỗi mẻ thường kéo dài khoảng 144-180 giờ. Kết thúc quá trình lên men người ta cố gắng lọc sớm dịch lên men, làm lạnh rồi chuyển sang công đoạn trích ly và tinh chế thu penicillin.
Đặc điểm về thiết bị lên men quá trình lên men sản xuất penicillin ngày nay chủ yếu được tiến hành trong thiết bị lên men chìm chế tạo bằng nhóm thép chịu ăn mòn CT2 với khuấy trộn kiểu tuôcbin (gồm nhiều tầng cánh khuấy, kết hợp bố trí hệ vách dẫn dòng trong thùng). Công suất khuấy trộn tiêu hao được thiết kê khoảng 3kW/m Ygiờ. Không khí nén đã vô khuấn được cấp vào qua hệ ống phân phối kiểu vòng xoáy hay kiểu rẻ quạt đục lỗ lắp đặt sát dưới đáy (hay phía dưới cánh tuốc-bin). Bên trong thiết bị được lắp đặt nhiều tầng ống trao đổi nhiệt kiểu vòng xoắn kết hợp đồng thời với trao đổi nhiệt qua thành thiết bị hai lớp vỏ, đảm bảo điều nhiệt hiệu quả trong suốt quá trình lên men. Dung tích thiết bị phổ biến trong khoảng 150-300m3, hệ số đổ đầy thường chọn khoảng 80%v (phụ thuộc vào kỹ thuật và thiết bị phá bọt). Thiết bị nhâu giông sản xuất có dung tích khoảng 10%v thiết bị lên men, được thiết kế tương tự và thường được ghép cứng với thiết bị lên men. Toàn bộ thiết bị lên men sản xuất, thiết bị nhàn giống 1 ớn và hệ thống các trang thiết bị phụ trợ được thiết kế và lắp đặt đảm bảo có thể vệ sinh và thao tác vận hành theo chế độ vô khuẩn cao (tốt nhất nên bố trí sao cho có thể áp dụng chế độ thanh trùng đồng thời cho toàn bộ hệ thiết bị này). Các thông số kiểm tra quá trình lên men bao gồm: pH môi trường, nồng độ oxy hòa tan, nhiệt độ, hàm lượng sinh khối và tốc độ biến thiên lượng sinh khối, số lượng, kích thước và cấu trúc pellet, nồng độ các cấu tử cơ chất, nồng độ penicillin, thành phần khí thải và các chỉ tiêu kiểm tra về vi sinh vật. Việc giám sát và điều chỉnh quá trình lên men được xây dựng trên cơ sở khai thác cả hai kiểu tương tác trực tuyến (Online control) và tương tác không phản hồi theo quy luật (offline control), phụ thuộc vào khả năng đáp ứng của hệ thiết bị hiện có. Đồng thời xu hướng máy tính hóa trong kiểm tra và giám sát quá trình lên men đang dần chiếm ưu thế trong sản xuất công nghiệp.
2.3.4. Hiệu quả kinh tế chung của quá trình lên men:
Năng lực sinh tổng hợp và tích tụ penicillin trong dịch lên men là kết quả của mối tương tác đồng thời của hàng loạt yếu tố công nghệ như: hoạt tính sinh tổng hợp của chúng, công nghệ lên men áp dụng, chất lượng nguyên liệu, đặc tính thiết bị và năng lực đáp ứng các yêu cầu công nghệ của thiết bị, chế độ giám sát và điều chỉnh các thông số công nghệ, năng lực và kỹ năng vân hành của công nhân…. Với nguồn cơ chất chính là glucoza và lên men theo phương pháp chìm, hệ số phân bổ nguyên liệu dự tính khoảng 25% glucoza được nấm mốc sử dụng để tổng hợp hệ sợi, 65% đường được sử dụng để duy trì sự sống sót của hệ sợi, còn lại chỉ khoảng 10% được nấm mốc sử dụng để tổng hợp penicillin. Hệ số sử dụng thức ăn nitơ và lưu huỳnh để tổng hợp penicillin tương ứng là 20% và 80%. Nồng độ penicillin G trong dịch lên men những năm 80 – 90 của thế kỷ XX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng năng suất khoảng 40 – 50 kg penicillin G/ m3 dịch lên men)
2.4. XỬ LÝ DỊCH LÊN MEN VÀ TINH CHẾ THU PENICILLIN TỰ NHIÊN:
Công đoạn xử lý dịch lên men và tinh chế thu penicillin tự nhiên được tóm tắt trong sơ đồ hình 2.9 , bao gồm các công đoạn chính sau đây:

Hình 2.9. Sơ đồ tóm tắt công đoạn xử lý dịch lên men thu penicillin tự nhiên

2.4.1. Lọc dịch lên men:
Mục đích: Penicillin là sản phẩm lên men ngoại bào. Vì vậy, ngay sau khi kết thúc quá trình lên men người ta thường tiến hành lọc ngay để giảm tổn hao do phân huỷ penicillin và giảm bớt khó khăn khi tinh chế, do các tạp chất tạo ra khi hệ sợi nấm tự phân.
Thiết bị lọc: phổ biến là thiết bị lọc hút kiểu băng tải hoặc kiểu thùng quay. Thông thường, người ta chỉ cần lọc một lần rồi làm lạnh dịch ngay để chuyển sang công đoạn tiếp theo. Chỉ trong những trường hợp rất đặc biệt mới cần phải xử lý kết
tủa một phần protein và lọc lại dịch lần thứ hai. Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hâu quả làm cho dịch khó lọc hơn.
Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm được rửa sạch, sấy khô và sử dụng để chế biến thức ăn gia súc.
2.4.2. Trích ly:
Penicillin thường được trích ly ở dạng axít ra khỏi dịch lọc bằng dung môi amylacetat hoặc butylacetat ở pH = 2,0 – 2,5, nhiệt độ 0 – 30C. Nhằm hạn chế lượng penicillin bị phân huỷ, quá trình trích ly được thực hiện trong thời gian rất ngắn trong thiết bị trích ly ngược dòng liên tục kiểu ly tâm nhiều tầng cánh. Đồng thời, trong thời gian trích ly cần giám sát chặt chẽ các thông số công nghệ như: nhiệt độ pH, độ vô
khuẩn…. để hạn chế tổn thất do phân huỷ penicillin. Dịch lên men sau khi lọc được bơm trộn đồng thời với dung dịch H2SO4 hoặc H3PO4 loãng có bổ sung thêm chất chống tạo nhũ và bơm song song cùng với dung môi trích ly vào trong thiết bị. Tỉ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn trong khoảng 4 – 10V dịch lọc /1V dung môi. Trong một số công nghệ, nhằm cải thiện chất lượng sản phẩm, người ta có thể áp dụng
phương pháp trích ly hai lần dung môi, với lần đầu trích ly penicillin bằng amylacetat hoặc butylacetat; tiếp theo penicillin lại được trích ly ngược sang dung dịch đêm pH = 7,2 – 7,5, thường là dung dịch KOH loãng hoặc dung dịch NaHCO3; sau đó
penicillin lại được trích ly sang dung môi lần thứ 2, với lượng dung môi ít hơn.(hình 2.10)

Hình 2.10. Sơ đồ công nghệ trích ly 2 lần dung môi tinh chế penicillin

2.4.3. Tẩy màu:
Để tẩy màu và loại bỏ một số tạp chất khác, người ta thường bổ sung trực tiếp chất hấp phụ vào dung môi chứa penicillin sau trích ly, sử dụng phổ biến nhất là than hoạt tính. Sau đó than hoạt tính được tách và rửa lại bằng sử dụng thiết bị lọc hút băng tải hoặc thiết bị lọc hút kieu thùng quay. Phần than sau lọc được đưa đi chưng thu hồi dung môi và xử lý hoàn nguyên, phục vụ cho các mẻ sau.
2.4.4. Kết tinh, lọc, rửa và sấy thu penicillin tự nhiên:
Việc kết tinh penicillin V hay penicillin G dưới dạng muối có thể được thực hiện rất đơn giản, bằng cách bổ sung trực tiếp vào dung môi sau khi tẩy màu một lượng nhỏ kali acetat (hay natri acetat) hoặc người ta trích ly lại sang dung dịch KOH loãng (hay NaOH loãng), tiến hành cô chân không ở nhiệt độ thấp, sau đó bổ sung BuOH đe penicillin tự kết tinh. Các thông số công nghệ có ảnh hưởng lớn đến hiệu qủa kết tinh là: nồng độ penicillin, nồng độ muối acetat, pH dung môi hay pH dung dịch cô đặc, nhiệt độ kết tinh … Sau khi kết tinh, tinh thể penicillin được lọc tách bằng máy lọc hút thùng quay. Để đảm bảo độ tinh khiết cao hơn, có thể tiến hành hòa tan và kết tinh lại penicillin. Khi sản phẩm đã đạt độ tinh sạch theo yêu cầu, thường độ tinh khiết không dưới 99,5%, chúng được lọc tánh tinh thể; tiếp theo rửa và làm khô sơ bộ bằng dung môi kỵ nước như izopropanol hay butylalcohl; hút chân không tách dung môi trên máy lọc băng tải rồi sấy bằng không khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin. Sản phẩm này, một phần được sử dụng trực tiếp để pha chế thuốc kháng sinh penicillin; còn lại, phần lớn được sử dụng làm nguyên liệu phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm penicillin và cephalosporin bán tổng hợp khác. Ngoài ra, để sản xuất ra các sản phẩm penicillin có độ tinh khiết rất cao, người ta cần phải sử dụng phối hợp thêm một số giải pháp công nghệ khác.

2.5. SẢN XUẤT CÁC BETA-LACTAM BÁN TỔNG HỢP TỪ PENICILLIN G

2.5.1. Nhu cầu sản xuất các penicillin bán tổng hợp:

Tác dụng điều trị chính của penicillin và các kháng sinh khác thuộc họ P-lactam được xác định là: cấu trúc penicillin có nhiều điểm gần gũi với dipeptit D-alanin-D- alanin, là hợp phần cấu trúc của lớp peptido-glucan thành te bào. Do sự tương đồng về đặc tính và cấu trúc này làm cho hoạt tính các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp te bào bị bien đổi, các enzym này đã nhân “nhầm” cơ chất. Kết quả là phần thành tế bào mới tổng hợp với sự “nhầm lẫn” trên sẽ không được hình thành, làm cho thành te bào của mầm bệnh chỉ có từng phần hay chúng hoàn toàn không có thành te bào do đó chúng dễ dàng bị tự phân trong môi trường và bị các công cụ tự vệ của cơ thể bệnh nhân tiêu diệt. Đồng thời, các kháng sinh P-lactam còn liên ket đặc hiệu với một số protein trên màng tế bào chất (đen nay đã xác định được chín protein trên). Sự liên kết này đã làm “bất hoạt” và “hòa tan” các protein đặc hiệu trên màng, dẫn đến làm mất hoạt tính polymeraza và ATPaza (người ta đã xác định được trong môi trường kháng sinh chỉ có các D-alanin -cacboxylpeptidaza còn hoạt động và một số ACPaza này lại có hoạt tính B-lactamaza yeu). Ngoài ra, người ta còn phát hiện thấy ảnh hưởng của pencillin đen các chuyển hóa photpholipit trong te bào.
Tuy nhiên nhiều trường hợp điều trị với penicillin đã xuất hiện dấu kháng thuốc. Nguyên nhân chính của hiện tượng kháng penicillin này là chúng tổng hợp đuợc một trong hai enzym penicillinaza và đặc biệt là enzym P-lactamaza. Gen mã hóa sinh tổng hợp enzym P-lactamaza được lưu giữ trên các plasmid (hoặc trasporon ). Vì vây, cùng với thời gian điều trị, năng lực kháng thuốc của chúng sẽ trở nên thành thục. Để vô hiệu khả năng kháng thuốc nêu trên, về nguyên lý, giải pháp đơn giản hơn cả là làm vô hiệu khả năng tương tác của enzym với cơ chất bằng cách làm bien đổi cấu trúc phân tử penicillin.
Để tạo ra các penicillin khác nhau, trên nguyên tắc có thể hoàn thiện theo hướng lên men trực tiep với các tiền chất tạo nhánh thích hợp để thu các .penicillin mong muốn hay lên men không sử dụng tiền chất thu axit 6- aminopenicillanic làm nguyên liệu để tổng hợp ra các penicillin khác. Tuy nhiên, bằng con đường lên men trực tiep cho đến nay người ta mới chỉ có khả năng lên men được một vài loại penicillin. Trong khi đó, con đường kinh te hơn cả và được triển khai trong sản xuất lớn lại là chỉ lên men trực tiep thu penicillin G (hoặc penicillin V) làm ra nguyên liệu, để từ đó tổng hợp ra penicillin bán tổng hợp khác. Ngoài ra, bằng con đường bán tổng hợp penicillin G hoặc penicillin V, có thể sản xuất ra một số dẫn xuất p -lactam có giá trị như các cepalosporin bán tổng hợp hay các penicillin có hoạt tính kìm hãm P- lactamaza.

2.5.2 Sản xuất axit 6- aminopenicillanic và sản xuất penicillin bán tổng hợp

Axit 6- aminopenicillanic tuy không có hoạt tính kháng khuẩn, nhưng có thể sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp ra nhiều loại penicillin khác nhau và cả cephalosporin. Để sản xuất axit 6- aminopenicillanic, con đường hiệu quả hơn cả hiện nay là lên men sản xuất penicillin G (hoặc penicillin V); sau đó áp dụng phương pháp hóa học hay sử dụng enzym acylaza để phân cắt mạch nhánh bên xem sơ đồ hình 2.11.

Hình 2.11. Sơ đồ tổng hợp axit 6- aminopenicillanic từ penicillin G

Phương pháp hóa học có hiệu suất chuyển hóa cao, tới 90-95%, và tốc độ phản ứng nhanh, song lại tiêu hao nhiều năng lượng, nhiều dung môi và chứa đựng nguy cơ ô nhiễm môi trường cao. Trong khi đó, phương pháp enzym, tuy hiệu quả chuyển hóa thấp hơn nhưng điều kiện phản ứng êm dịu và mang lại hiệu quả kinh te cao hơn nên được triển khai phổ biến trong thực tiễn sản xuất công nghiệp. Đồng thời, cũng nhờ ưu thế trên, phương pháp enzym được hoàn thiện liên tục và ngày nay đã đạt được ưu thế vượt trội so với phương pháp hóa học (xem bảng 2.2).

Bảng 2.2.. Phân bố chi phí trong sản xuất axit 6- aminopenicillanic (40 tấn/năm theo hãng Snam Progetti)

Phân bổ chi phí Phương pháp hóa học Phương pháp enzym (chế phẩm enzym cố định trong triacetatcelluloza)
Sử dụng penicillin G tinh khiết Sử dụng penicillin G thô
Penicillin V 43,72 46,01 39,65
Hóa chất 7,19 0,78 1,39
Chế phẩm enzym 2,67 2,67
Vật tư khác 4,64 0,91 0,91
Nhân công 3,12 3,05 3,95
Khấu hao thiết bị 6,16 4,99 3,85
Chi phí khác 2,28 3,18 2,90
Tổng cộng 68,41 62,49 55,28

 

2.5.3 Sản xuất axit 7- deminodeaxetoxy-cephalosporin (7-ADCA) và sản xuất cepalosporin bán tổng hợp
Cepalosporin là họ chất kháng sinh thuộc nhóm p -lactam với đặc tính quý nhờ ít bị kháng thuốc hơn penicillin và được đánh giá an toàn hơn cho người bệnh. Các sản phẩm Cepalosporin bán tổng hợp khác nhau đều được tổng hợp từ sản phẩm trung gian là axit 7- deminodeaxetoxy-cepalosporin (7-ADCA xem mục 3). Sản phẩm 7-ADCA này có thể được tổng hợp từ penicillin G , từ axit 6- aminopenicillanic hay từ
cepalosporin C là (một sản phẩm lên men tự nhiên), trong đó đến cuối thế kỷ XX con đường hiệu quả kinh tế nhất vẫn là tổng hợp từ penicillin G theo sơ đồ 2.12
Từ sản phẩm 7-ADCA người ta dễ dàng acyl hóa bằng các mạch nhánh tương ứng để sản xuất ra các cepalosporin bán tổng hợp, trong đó bao gồm theo cả hai hướng là thay thế nhánh tai vị trí C7 (thí dụ như cephalecin,cephadrin, cephadroxil…), hay thay thế các đồng thời mạch nhánh tại cả hai vị trí C3 và C7 (như: cephazolin,
cephatrizin, cefoperazon,cephamadol,cefotiam….)
2.5.4. Sản xuất các B-lactam bán tổng hợp các hoạt tính kìm hãm p – lactamaza
Bên cạnh các ứng dụng nêu trên, axit 6- aminopenicillanic còn được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất một số chế phẩm penicillin bán tổng hợp có cả hoạt tính
kĩm hãm B-lactamaza (thí dụ như oxacillin, cloxacillin, dicloxacyllin, ílucloxacillin…),
hay kết hợp sử dụng axit clavunic hoặc olivanic làm mạch nhánh để làm tăng hiệu quả điều trị (hai axit này tuy có hoạt tính kháng sinh yếu nhưng có hoạt tính kìm hãm B- lactamaza (thí dụ như axit bromopenicillanic).

Hình 2.12. Sơ đồ tổng hợp hóa học axit 7-ADCA từ penicillin G

 

CHƯƠNG 3
CÔNG NGHỆ LÊN MEN CEPHALOSPORIN VÀ CEPHAMY CIN
3.1. ĐẠI CƯƠNG
Cephalosporin và cephamycin thuộc họ chất kháng sinh có cấu trúc vòng chính gồm vòng p -lactam liên kết với vòng dihydrotiazin (hình 3.1). Ngày nay, người ta đã phát hiện được nhiều loại nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn khác nhau có khả năng tổng hợp Cephalosporin; nhưng khả năng tổng hợp cephamycin mới tìm thấy ở xạ khuẩn và một vài chủng Norcardia.

Hình 3.1. Một vài sản phẩm cephalosporin và cephamycin lên men tự nhiên

Chất kháng sinh điển hình cho họ này là cephalospoin C được newton và Abaraham phát hiện năm 1956 (Nagarajan và đồng nghiệp phát hiện được cephamycin muộn hơn vào năm 1971). Ưu điểm lớn nhất Cephalosporin C là có tác dụng kháng khuẩn đối cả cầu khuẩn có hoạt tính B-lactamaza nhiều vi khuẩn Gram âm hầu như không độc (liều tiêm dưới da LD50 là 4g/kg thể trọng). Đe sản xuất ra các CephalosporinC người ta thường sử dụng các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cao của loài cephalosporium acremonium. Cơ che quá trình tổng hợp Cephalosporin C cũng qua sản phẩm trung gian penicillin N rồi chúng được chuyển hóa tiep tục theo sơ đồ 3.2 tiếp theo cepaloporin C qua quá trình metoxyl hoá tại vị trí C7 sẽ hình thành cephamycin. Điểm đặc biệt của quá trình hình thành cephalosporin C là mạch nhánh a- aminoadipyl liên kết đặc hiệu hơn với vòng p – lactam (hoặc chính các chủng này không có enzym acyltransferaza), nên việc sử dụng các tiền chất tạo nhánh thay the trong quá trình lên men nhằm thu nhân các cephalosporin khác hầu như không thu được hiệu quả đáng kể .

Hình 3.2. Cơ chế tổng hợp cephalosporin C ( giai đoạn cuối từ penicillin N)

3.2. Điểm công nghệ lên men:
Cũng như với hầu hết các chất kháng sinh khác, công nghệ lên men sản xuất cephalosporin c được các hãng bảo mật. về nguyên lý công nghệ, quá trình lên men cephalosporin c có nhiều điểm tương đồng với công nghệ lên men sản xuất penicilhn, với việc sử dụng các chủng công nghiệp hoạt lực cao thành phần môi trường và các thông số công nghệ lên men được tối ưu hóa… Sau đó, từ cephalosporin c, bằng phương pháp enzym hoặc phương pháp tổng hợp hóa học, có thể tổng hợp được axit 7-amino-cephalospoianic (7-A.CA) hay axit 7-aminodeacetoxycephalosporanic (7-ADCA – hình 3.3). Từ sản phẩm trung gian này có thể sản xuất ra nhiều chế phẩm cephalosporin bán tổng hợp khác. Tuy nhiên, việc nghiên cứu hoàn thiện và triển khai sản xuất công nghiệp cephalosporin c gặp khó khăn hơn nhiều so với quá trình lên men sản xuất penicillin. Năng lực tích tụ cephalosporin (hay cephamycin) của các chủng gốc thường rất thấp và việc tuyển chọn, cải tao hoạt tính chủng trong khoảng thời gian dài chưa tạo ra được các chung co nang lục siêu tổng hợp cao như mong muốn. Đồng thời, các chủng lên men cephalosporin dường như không có hoạt tính enzym acyltransferaza nên việc sử dụng tiền chất tạo nhánh nhằm thay đổi phổ sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men cephalosporin không mang lại kết quả đáng kể. Trong khi đó, bằng phương pháp hóa học từ penicillin G (hay penicillin V) người ta dễ dàng thu được axit 7-ADCA với hiệu quả kinh tế cao hơn so với từ cephalosporm c (hình 2.11). Đây cũng có thể là một trong những nguyên nhân làm cho việc nghiên cứu tìm kiếm cephalosporin hay cephamycin tự nhiên mới và việc hoàn thiện công nghệ lên men hai họ kháng sinh này trong khoảng thời gian dài không được triển khai mạnh mẽ như nhiều họ sản phẩm kháng sinh khác. Khoảng hai mươi năm gần đây, việc áp dụng các kỹ thuật tạo chủng tiên tiến, các phương pháp nghiên cứu hiện đại sử dụng trang thiết bị phân tích có độ chính xác cao đã cho phép khám phá ra cơ chê phân tử của quá trình lên men; phối hợp với việc áp dụng kỹ thuật vận hành và điêu chinh quá trình lên men hiện đại, đã mở ra triển vọng mới cho nhóm sản phâm này. Vì vậy, hướng nghiên cứu xây dựng và hoàn thiện công nghệ lên men cephalosporin tự nhiên trong vài năm gần đây đã lại được tiếp tục triển khai.

Các sản phẩm cephalosporin bán tổng hợp bao gồm cả nhóm sản phẩm acyl hóa gốc 7-amin và nhóm sản phẩm thay thế gốc acetoxy- ở vị trí c3’; công thức hóa học của một số sản phẩm bán tổng họp thương mại phổ dụng được giới thiệu trong hình 18. về cấu trúc, cephalosporin và cephamycin cùng thuộc nhóm kháng sinh beta-lactam nên chúng có cùng cơ chế tác dụng lên quá trình tổng họp thành tế bào của mầm bệnh, tương tự như penicillin. Tuy nhiên, so với trường hợp penicillin, người ta đã phát hiện thấy có sự khác biệt về loại protein đặc hiệu trên màng liên kết với cephalosporin và cephamycin. về hoạt tính kháng khuẩn, ngoài phổ kháng khuẩn rộng trên các vi khuẩn Gram dương, nhiều kháng sinh nhóm này tác dụng lên cả một số vi khẩn Gram âm và một số khác tác dụng hiệu quả lên cả các chủng vi khuẩn có hoạt tính beta-lactamaza điển hình.

Hình 3..3. Sơ đồ phản ứng biến đổi cephalosporrin C thành axit 7- ADCA
Hình 3.4. Cấu trúc một số kháng sinh cephaslosporin bán tổng hợp phổ dụng

CHƯƠNG 4
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC KHÁNG SINH KHÁC
1. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC KHÁNG SINH CÓ NGUỒN GÓC TỪ XẠ KHUẨN
1.1. CÔNG NGHỆ LÊN MEN KHÁNG SINH NHÓM AMINOSID (MINOGLYCOSID)
1.1.1. Streptomycin
1.1.2. Neomycin
1.2. CÔNG NGHỆ LÊN MEN KHÁNG SINH NHÓM TETRACYLIN
1.2.1. Tetracyclin ( Acromycine, tetracin)
1.2.2. Oxytetracyclin ( terramydn…)
1.3. CÔNG NGHỆ LÊN MEN KHÁNG SINH NHÓM MACROLID
Erythomycin:
1.3.1. Đặc điểm chủng Streptomyces erythreus
1.3.2. Điều kiện sinh tổng hợp.
1.3.3. Chiết xuất
1.4. KHÁNG SINH CHỐNG NẤM CANDIDA: NYSTATINE
2. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH CÓ NGUỒN GÓC VI KHUẨN
3. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH KHÁNG NẤM
PHẦN 3.
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮC XIN CHO NGƯỜi
CHƯƠNG 7
CƠ SỞ SINH HÓA CỦA CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮC XIN
1. Hệ thống miễn dịch của cơ thể:
1.1. Khái niệm:
Miễn dịch (hay miễn nhiễm) là tập hợp tất cả các cơ chế sinh học giúp cho một cơ thể đa bào giữ được sự liên kết giữa các tế bào và các mô, đảm bảo sự toàn vẹn của cơ thể bằng cách loại bỏ những thành phần bị hư hỏng cũng như các chất và sinh vật xâm hại. Chức năng bảo vệ cơ thể bao gồm hai loại cơ chế miễn dịch, lần lượt xuất hiện trong quá trình tiến hóa của các loài và liên hệ chặt chẽ với nhau ở các động vật bậc cao
1.2. Cơ chế bảo vệ cơ thể
1.3. Phân loại miễn dịch:
• Miễn dịch tư nhiên (hay miễn dịch không đặc hiệu), đáp ứng tức thì.
• Miễn dịch thu được (miễn dịch đặc hiệu), đáp ứng sau vài ngày vói đặc điểm là khả năng “ghi nhớ”.
Ở cấp độ phân tử, cả hai cơ chế đều có khả năng phân biệt (“nhận diện”) các thành
phần của cơ thể, tức cái “ta” với tất cả những phân tử khác gọi chung là cái “không ta”.
Miễn dịch đặc hiệu xuất hiện vào thòi điểm phân kỳ giữa đông vât có xuơng sống và đông vât không xuơng sống cách đây 500 triệu năm. Miễn dịch tư nhiên có tính nguyên thủy hơn, cần thiết cho sư sinh tồn của mọi sinh
1.3.1. Miễn dịch tư nhiên
1.3.2. Miễn dịch tiếp thu ( Miễn dịch thu được)

– Miễn dịch thu được chủ động:
– Miễn dịch thu được thụ động:
. Miễn dịch thu được thụ động tự nhiên: là trạng thái MD thu đuoc do kháng thể ghép hoặc truyền từ sữa mẹ.
. Miễn dịch thu được thụ động nhân tạo là MD nhờ kháng thể chuyển từ bên ngoài do truyền kháng huyết thanh
1.4. Chất sinh miễn dịch và kháng nguyên:
Bất kỳ một chất nào khi đưa vào cơ thể động vật ở điều kiện thích hợp gây ra đáp ứng MD đều được gọi là chất sinh miễn dịch.
Bất cứ chất nào khi gắn với thành phần đáp ứng miễn dịch ( kháng thể hoặc tế bào lympho hoặc cả hai) đều được gọi là kháng nguyên. ( nghĩa là các chất khi đưa vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể tạo nên kháng thể.
Tất cả các chất sinh miễn dịch đều là kháng nguyên, song có một số chất được coi là kháng nguyên nhưng không gây đáp ứng MD.Ví dụ Hapten.
Tất cả các protein tự nhiên của động vật , thực vật và vi sinh vật ở trạng thái keo đều có tính kháng nguyên.
Các chất độc thực vật ( abin, robin, crotin, rixin, curxin), các chất độc động vật ( nọc rắn, nọc ong, nhện…),
Một số polysacarit vi sinh vật, các phức hợp protein với lipit, protein với polysacarit cũng có khả năng kích thích cơ thể để tạo thành kháng thể.
Dưới tác dụng của fcmalin hay nhiệt độ, các ngoại độc tó bị mất độc tính nhưng tính chất kháng nguyên hầu như vẫn còn giữ nguyên. Lúc này được gọi là anatoxin. Anatoxin được dùng phổ biến để gây miễn dịch chủ động cho người chống lại các bệnh như các bệnh Bạch hầu, uốn ván v..v.
1.4.1. Điều kiện của một chất sinh MD:
– Tính lạ: Chất được gọi là kháng nguyên trước hết phải là một chất lạ đối với cơ thể, bởi vì bình thường cơ thể không đáp ứng bảo vệ với các chất bản thân. Chất càng lạ bao nhiêu khả năng kích thích tạo kháng thể càng mạnh bấy nhiêu.
– Khối lượng phân tử lớn: Kháng nguyên có KL phân tử > 10000 dalton. Nếu < 1000 dalton ( penicillin, progesteron, aspirin …) thì không có tính sinh MD. Từ 1000 dến 6000 dalton ( insulin) có thể có hoặc không có khả năng đáp ứng MD.
– Cấu trúc phân tử phức tạp: Chất có cấu trúc phân tử càng phức tạp thì tính mD càng cao..VDb Poly lizin là 1 polyme có KL phân tử 3000 dalton, nhưng không gây đáp ứng MD vì có cấu trúc đơn giản, trong khi đó Hapten tuy có khối lượng phân tử nhỏ vf không có tính sinh MD, nhưng khi gắn với chất có KL phân tử cao ( như protein) lại trở thành một chát sinh MD.
Như vây chất sinh MD nếu không đủ 3 yếu tố trên thì cần phải gắn với chất mang để làm tăng KL phân tử hoặc có mức độ phức tạp về cấu trúc.
1.4.2. Tính đặc hiệu của kháng nguyên:
Sự liên kết giữa kháng nguyên với kháng thể hay giữa kháng nguyên với tế
bào lympho luôn mang tính đặc hiệu cao. Tính đặc hiệu này tương tự như giữa enzim với cơ chất, ghĩa là khớp với nhau như khoa với chìa..
Kháng thể hay tế bào lympho không phải liên kết với toàn bộ kháng nguyên mà chỉ với một phần nhất định của kháng nguyên gọi là quyết định kháng nguyên hay là epitop. Kích thước của epitop khoảng 7x12x 35 A0 gồm 5-7 axit amin
Phần tương ứng của nó trên mỗi kháng thể gọi là vị trí kết hợp kháng nguyên hay là paratop. Paratop có kích thước tương tự
Phần tương ứng với quyết định kháng nguyên nằm trên tế bào lympho gọi là thụ thể. Chẳng hạn thụ thể của tế bào T là TCR ( T – cell receptor).
Mỗi epitop chỉ gắn đặc hiệu với một paratop của kháng thể hoặc hoặc TCR và chỉ sinh ra một dòng kháng thể đặc hiệu. Một kháng nguyên có nhiều epitop khác nhau sẽ tạo thành nhiều dòng kháng thể khác nhau tương ứng với từng epitop
Tính đặc hiệu trong liên kết giữa kháng thể với kháng nguyên được ứng dụng thành một phương tiện tầm soát các chất trong nhiều kỹ thuật chẩn đoán. Các kháng thể đặc hiệu đối với một kháng nguyên mong đợi có thể được gắn nhãn phóng xạ hay huỳnh quang hoặc các enzyme tạo màu rồi sử dụng như các “đầu dò” để tìm kiếm
kháng nguyên đó.
Các ứng dụng nổi tiếng bao gồm immunoblot, ELISA và nhuộm hóa mô miễn dịch các tiêu bản hiển vi. Tốc độ, độ chính xác và sự đơn giản của các xét nghiệm trên đã thúc đẩy sự phát triển của các kỹ thuật chẩn đoán nhanh in vivo các bệnh, vi khuẩn và cả các chất ma túy. Xét nghiệm sự tương hợp các nhóm máu cũng trên cơ sở phản ứng kháng nguyên-kháng thể.
1.5. Kháng thể:
Kháng thể là các globulin xuất hiện trong máu của động vật khi đưa kháng nguyên vào cơ thể , có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó. Kháng thể được định nghĩa trên đây gọi là kháng thể MD ( Ig- Imunnoglobulin) hay kháng thể đặc hiệu.
Kháng thể chủ yếu tìm thấy trong huyết thanh của động vật, vì vậy huyết thanh chưa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên gọi là kháng huyết thanh.
Kháng thể còn tìm thấy ở trrong các thể dịch khác của cơ thể, như sữa. Những kháng thể có trong sữa hay huyết tương của người và của động vật từ trước khi có sự tiếp xúc với kháng nguyên gọi là kháng thể tự nhiên hay kháng thể không đặc hiệu
2. Các tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch:
Hệ thống miễn dịch gồm nhiều cơ quan và nhiều loại tế bào nằm rãi rác khắp cơ thể, tác động qua lại nhau để dẫn đến đáp ứng MD cuối cùng.
Ngay cả trước khi khái niệm miễn dịch được hình thành, nhiều thầy thuốc cổ đại đã mô tả những cơ quan mà về sau người ta chứng minh được là thuộc hệ miễn dịch. Các cơ quan chính của hệ miễn dịch gồm tuyến ức, lách, tùy xương, các mạch lympho, hạch lympho và các mô lympho thứ cấp (như các hạch amiđan, V.A.) và da. Các cơ quan chính, tuyến ức và lách, đã được nghiên cứu đơn thuần về mặt mô hoc qua các tử thiết. Ngoài ra, có thể dùng phẫu thuât lấy ra các hạch lympho và một số mô lympho thứ cấp để nghiên cứu khi bệnh nhân còn sống (sinh thiết).
Nhiều tế bào thuộc hệ miễn dịch không liên kết với một cơ quan đặc biệt nào, mà chỉ tâp trung hoặc lưu chuyển giữa nhiều mô trong khắp cơ thể.
Trong hệ thống MD có 2 loại tế bào chính là: Các tế bào lympho và các đại thực bào
Tế bào chủ chốt tham gia vào đáp ứng MD là tế bào lympho, tổ chức có chứa tế bào lympho và tham gia vào đáp ứng MD gọi là tổ chức lympho.
Lympho có nguồn gốc từ các tế bào nguồn, còn gọi là tế bào gốc, không biệt hóa, ở tuỷ xương. Từ tế bào nguồn, nhiều dòng tế bào có chức năng khác nhau được biệt hóa rồi sau đó trải qua một quá trình thành thục hay chín khi kết hợp với các tổ chức chuyên hóa.
3. Tính chất của miễn dịch:
3.1. Tính đặc hiệu: Kháng nguyên nào thì kháng thể nấy. Mỗi kháng nguyên chỉ có thể kết hợp vừa khớp với một loại kháng thể đặc hiệu do chính nó kích thích tạo thành. Nó khớp với nhau như khóa với chìa. Tính đặc hiệu này do cấu trúc bề mặt các phân tử kháng nguyên và kháng thể quyết định.
3.2. Tính ghi nhớ: Sau khi tiếp xúc với kháng nguyên, cơ thể có thể hình
thành đáp ứng miễn dịch nhớ. Nếu lần sau có dịp tiếp xúc với kháng nguyên thì cơ thể sẽ tạo một đáp ứng miễn dịch nhanh và mạnh hơn để diệt tác nhân gây bệnh
CHƯƠNG 8
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮC XIN
1. Khái niệm về vắc-xin
1.1. Định nghĩa vacxin:
Vắc-xin là chế phẩm có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịch dăc hiêu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một (số) tác nhân gây bênh cụ thể. Các nghiên cứu mới còn mở ra hướng dùng vắc-xin để điều trị một số bênh (vắc-xin
liêu pháp, một hướng trong các miễn dịch liêu pháp). Thuật ngữ vắc-xin xuất phát từ vaccinia, loại virus gây bênh đậu bò nhưng khi đem chủng cho người lại giúp ngừa
được bênh đậu mùa (tiếng Latinh vacca nghĩa là “con bò cái”). Viêc dùng vắc-xin để phòng bênh gọi chung là chủng ngừa hay tiêm phòng hoăc tiêm chủng, măc dù vắc- xin không những được cấy (chủng), tiêm mà còn có thể được đưa vào cơ thể qua
đường miệng.

Chuẩn bị vắc-xin cúm để chủng ngừa

1.2. Lịch sử và hướng phát triển của vắc-xin
Edward Jenner được công nhận là người đầu tiên dùng vắc-xin để ngừa bênh cho con người ngay từ khi người ta còn chưa biết bản chất của các tác nhân gây bênh (năm 1796). Louis Pasteur với các công trình nghiên cứu về vi sinh học và miễn dịch học đã mở đường cho những kiến thức hiên đại về vắc-xin.
Vào thế kỷ thứ nhất trước Công nguyên, vua Mithridate VI mỗi ngày đều uống một lượng nhỏ độc chất cho cơ thể quen dần nhằm đương đầu với nguy cơ bị ám sát. Chuyên kể rằng cách này đã tỏ ra hiêu quả vì về sau, khi Mithridate thất trận và tự sát, liều thuốc độc ông ta uống vào chẳng có ép phê gì.
Ở Trung Quốc, vào khoảng thế kỷ thứ 10, các thầy lang Đạo giáo đã bí mật dùng một kỹ thuật phòng bênh đậu mùa. Đậu mùa là chứng bênh hiểm nghèo, nếu không giết chết bênh nhân thì nó cũng để lại những vết seo rỗ trên măt. Các thầy lang đã lấy vẩy seo của người bị bênh(chứa mầm bênh), cho vào một chiếc hộp kín rồi giữ ở nhiêt độ nhất định trong một thời gian để giảm độc tính, sau đó nghiền nhỏ thổi vào mũi của người khỏe chưa từng mắc bệnh đâu mùa để ngừa bệnh.
Một phương pháp tương tự cũng được dùng ở Thổ Nhĩ Kỳ vào the kỷ 18.
Bỏ qua những huyền thoại lẻ loi và không chắc chắn trên, vắc-xin đầu tiên gắn với tên tuổi của Edward Jenner, một bác sĩ ngưỏị Anh. Năm 1796, châu Âu đang có dịch đâu mùa, Jenner đã thực hiện thành công thử nghiệm vắc-xin ngừa căn bệnh này. Kinh nghiệm dân gian cho thấy những nông dân vắt sữa bò có thể bị lây bệnh đâu bò, nhưng sau khi khỏi bệnh, họ trở nên miễn nhiễm đối với bệnh đâu mùa. Dựa vào đó, Jenner chiết lấy dịch từ các vết đâu bò trên cánh tay của cô bệnh nhân Sarah Nelmes rồi cấy dịch này vào cánh tay của câu bé 8 tuổi khỏe mạnh cùng làng tên là James Phipps. Sau đó Phipps đã có những triệu chứng của bệnh đâu bò. 48 ngày sau, Phipps khỏi hẳn bệnh đâu bò, Jenner liền tiêm chất có chứa mầm bệnh đâu mùa cho Phipps, nhưng Phipps không hề mắc căn bệnh này. Cách làm của Jenner xét theo các tiêu chuẩn y đức ngày nay thât không ổn, nhưng rõ ràng đó là một hành động có tính khai phá: đứa trẻ được chủng ngừa đã đề kháng được bệnh.
Thời của Jenner, các virus vẫn chưa được khám phá, còn vi khuẩn tuy đã được tìm ra nhưng vai trò gây bệnh của chúng chưa được biet. Thời điểm 1798, khi Jener công bố kết quả thí nghiệm của mình, người ta chỉ hình dung là có các “mầm bệnh” . gây nên sự truyền nhiễm
±—Sau thí nghiệm thành công của Jenner, phương pháp chủng đâu được triển khai rộng rãi. Tính đến năm 1801, ở Anh đã có trên 100.000 ngưỏi được chủng.
Tám mươi năm sau, Louis Pasteur nghiên cứu bệnh tả khi dịch tả đang tàn sát đàn gà. Ông cấy các vi khuẩn tả trong phòng thí nghiệm rồi đem tiêm cho gà: những con bị tiêm chết sạch. Mùa hè năm 1878, ông chuẩn bị một bình dung dịch nuôi cấy vi khuẩn dạng huyền phù, rồi để đó, đi nghỉ mát. Khi trở về, ông lại trích lấy huyền phù đó đem tiêm cho gà. Lần này thì bầy gà chỉ bị bệnh nhẹ rồi cả đàn cùng khỏe lại. Pasteur hiểu ra rằng khi ông đi vắng, đám vi khuẩn trong huyền phù đó đã bị biến tính, suy yếu đi. Ông bèn lấy vi khuẩn tả (bình thường) đem tiêm cho những con gà vừa trải qua thí nghiệm trên và những con chưa hề bị chích vi khuẩn. Kết quả là những con nào từng được chích vi khuẩn (biến tính) thì có khả năng đề kháng lại mầm bệnh, bọn còn lại chết hết. Qua đó, Pasteur đã xác nhân các giả thuyết của Jenner và mở đường cho khoa miễn dịch học hiện đại.
Từ đó, chủng ngừa đã đẩy lùi nhiều bệnh: triệt tiêu bệnh đâu mùa trên toàn cầu, thanh toán gần như hoàn toàn bệnh bại liệt, giảm đáng kể các bệnh sởi, bạch hầu, ho gà, bệnh ban đào, thủy đâu, quai bị, thương hàn và uốn ván v.v. Nguyên tắc vẫn không có gì thay đổi: gây miễn dịch bằng một vi khuẩn hoặc virus giảm độc lực, hoặc với một proteinđặc hiệu có tính kháng nguyên để gây ra một đáp ứng miễn dịch, rồi tạo một trí nhớ miễn dịch đặc hiệu, tạo ra hiệu quả đề kháng cho cơ thể về sau khi tác nhân gây bệnh xâm nhập với đầy đủ độc tính.
Người ta còn hướng tới triển vọng dùng vắc-xin để điều trị một số bệnh còn nan y như ung thư, AIDS v.v.
Tuy nhiên, nhiều bệnh vẫn còn đang thách thức con người, chưa có vắc-xin nào đủ hiệu quả để ngăn ngừa. Trong đó phải kể nhiều bệnh do ký sinh trùng (thí dụ sốt rét, giun, sán), vi khuẩn (lao), virus (cúm, sốt xuất huyết, AIDS v.v.). Một số lý do có thể là các tác nhân gây bệnh biến đổi thường xuyên khiến cho miễn dịch không còn hữu hiệu hoặc thậm chí tấn công ngay vào hệ miễn dịch như trường hợp của HIV v.v. (Đã có lúc bệnh lao được đẩy lùi bằng nhiều biện pháp phối hợp (thuốc, vắc-xin và các biện pháp phòng ngừa khác), nhưng sự xuất hiện của AIDS đã làm cho dịch lao có dịp bùng phát, nhất là tại các nước đang phát triển.)
Lần đầu tiên trong lịch sử, con người đã thanh toán được một căn bệnh
hiểm nghèo. Ảnh chụp năm 1977, Ali Maow Maalin, người Somalia, được xem là bệnh nhân cuối cùng mắc bệnh đậu mùa.

* Một số loại vacxin đang được sử dụng ở Việt Nam:
Trong chương trình tiêm chủng mở rộng ở nước ta có 6 loai văc-xin được trình bày bằng bảng dưới đây:
Lịch tiêm chủng các vacxin trong chương trình tiêm chủng mở rộng:

Vacxin Liều

lượng

Đường tiêm chủng Tuổi tiêm chủng
BCG (phòng lao) 0,1ml Trong da (thường ở cánh tay trái) Sơ sinh hoặc bất kỳ thời gian nào sau đó
SABIN